Stejně jako jeho předchůdci, Dragonfly
500 a 200, nabízí i nový Dragonfly 600 systém čtyři klíčové zobrazovací modality –
rychlé spinning disk konfokální snímání, laserové widefield zobrazování,
pozorování v procházejícím světle (DIC, fázový kontrast, brightfield) a nové moduly
pro super-rezoluční mikroskopii (3D SMLM a B-TIRF*).
Technické parametry přístroje Dragonfly 600:
1. Dual-Microlens Spinning Disk
Při konfokální mikroskopii s rotujícím diskem je přes pinholes (otvory na disku) současně osvětleno více bodů
vzorku najednou. Světlo emitované vzorkem se znovu zobrazuje přes pinholes, čímž se „odfiltrují“ signály
pocházející mimo ohniskovou rovinu ještě před tím, než dopadnou na detektor (kameru). Proto se snižuje výkon
laseru potřebný k dosažení vynikajícího konfokálního obrazu. Tím se sníží pozadí a následně je umožněno
zobrazení hlouběji ve vzorku.
Výhody plynoucí ze spinning disk technologie:
-
Šetrné zobrazování vzorků – možnost zobrazování živých dějů bez fototoxicity a photobleachingu
-
Rychlé konfokální snímání
-
Zobrazení velmi rychlých živých dějů
-
Zvýšení information_blockivity při hlubokém zobrazováním tlustších vzorků
-
Zvýšení poměru signálu k šumu
2. Single molecule imaging
Dragonfly 600 má všechny potřebné nástroje pro metodu lokalizace jednotlivých molekul. Výkonný
laserový motor HLE poskytuje potřebný výkon laseru pro aplikace dSTORM a
DNA-PAINT. 3D SMLM používá astigmatický 3D super-rezoluční modul a poskytuje
snímky s nanometrovou přesností lokalizace a odpovídajícím rozlišením až 10 nm.
Lokalizaci jednotlivých molekul lze provádět pomocí 3D super-rezolučního modulu, který je kompatibilní se všemi
modalitami: widefield zobrazováním, konfokálním snímáním a TIRF. Obraz získaný v jedné rovině přes 3D
super-rezoluční modul poskytuje axiální informaci v rozsahu ~ 1 μm s odpovídajícím rozlišením až do 30 nm.
3. Citlivé detektory
Citlivost je fundamentálním parametrem všech mikroskopických
systémů. Určuje minimální detekovatelný signál pro danou intenzitu excitace. Součástí Dragonfly systému jsou
ty nejcitlivější EMCCD a sCMOS detektory na trhu.
Pro ty nejslabší signály lze použít detektory iXon EMCCD, které zachycují již 1.9 fotonu na
pixel s vysokým poměrem signálu k šumu. Nejnovější generace detektorů sCMOS nabízí vynikající
rovnováhu mezi citlivostí a rychlostí – kvantová účinnost až 95% a rychlost vyšší než
44 snímků za sekundu při plném rozlišení!
Více o Andor detektorech se dočtete v datových listech níže.
4. Borealis®
Borealis® je patentovaná technologie firmy Andor, která přináší špičkové uniformní
osvětlení celého zorného pole bez okrajové vinětace. Minimalizuje rozptyl v rovnoměrnosti excitace
(≤5 %) a výrazně zlepšuje výslednou kvalitu obrazu. Díky Borealis® dochází ke snížení
výskytu artefaktů vznikajících při stitchingu snímků a montážním zobrazování. Patentovaná
technologie Borealis® je k dispozici také v rámci nového unikátního modulu B-TIRF® u Dragonfly
600.
5. TIRF a B-TIRF
Unikátní modul Borealis® Total Internal Reflection Fluorescence (B-TIRF) je založený na
patentovaném systému Borealis®. Zabraňuje interferenci a pruhovaným artefaktům vyskytujících se
při standardním TIRF zobrazování a díky tomu poskytuje vynikající kvalitu obrazu. B-TIRF lze použít pro běžné
TIRF aplikace, jako je zobrazování dějů na okraji buněčné membrány (např. endo/exocytóza, fokální adheze a pohyb
buněk, dynamika virová infekce atd.)
V systému Dragonfly lze kombinovat B-TIRF s osvětlovacím zoomem nebo výkonným
laserovým motorem HLE (High power Laser Engine) a provádět tak experimenty lokalizace
jednotlivých molekul (SMLM) s výrazně zvýšeným poměrem signálu k šumu.
6. Laserové motory: ILE a HLE
U nové generace Dragonfly 600 lze zvolit mezi dvěma typy
laserového osvětlení:
ILE = Integrated Laser Engine nebo výkonnější varianta HLE = High Power Laser
Engine. Oba laserové motory nabízejí osvětlení multimódovými vlákny. Mulitmódová
vlákna přenášejí delší vlnové délky než jednovidová vlákna, vyžadují méně údržby a mohou dokonale
vyplnit čtvercový senzor kamery. Jak ILE, tak HLE, jsou vhodné pro zobrazování živých buněk a citlivých vzorků,
jelikož poskytují přísně kontrolovanou a šetrnou iluminaci. ILE i HLE jsou kompatibilní s novou
zobrazovací modalitou B-TIRF.
HLE navíc nabízí vysoký výkon (v řádech stovek mW až jednotek
Wattů) potřebný pro zobrazování jednotlivých molekul a výrazně urychluje
prostorové zobrazování u transkriptomických experimentů.
7. Intuitivní software
V rámci Dragonfly 600 systému jsou k dispozici celkem tři softwary:
AKVIZIČNÍ SOFTWARE FUSION:
Aplikace Fusion byla navržena tak, aby splňovala požadavky dnešních výzkumníků a poskytovala snadné použití a
okamžitou vizuální zpětnou vazbu pro kontrolu dat. Fusion zjednodušuje ovládání systému Dragonfly a zpřístupňuje
špičkovou mikroskopii všem uživatelům.
-
3D vizualizace v reálném čase umožňuje vhled do vašich experimentů
-
V protokolu lze aktivovat stitching a dekonvoluci, které poskytují zpracovaný obraz ihned po dokončení
snímání
-
Multi-well akvizice je k dispozici prostřednictvím snadného a intuitivního uživatelského rozhraní
podporujícího až 384 jamkových destiček: ideální pro snadné a rychlé prověřování vzorků, organoidů a
fenotypů
-
Pro rychlou akvizici lze také kombinovat Z-akvizici s novým režimem burst shutter
-
3D zobrazování jednotlivých molekul lze provádět v celých buňkách s minimální softwarovou interakcí
-
Ve všech zobrazovacích modalitách je k dispozici systém automatického zaostřování, který poskytuje stabilní a
přesné zobrazení ve všech bodech během celého experimentu
VÝKONNÝ ANALYTICKÝ SOFTWARE IMARIS ®
Analytický software Imaris ®
for Dragonfly je nedílnou součástí každého systému Dragonfly. Imaris ® for Dragonfly
Super-Resolution je nedílnou součástí nového systému Dragonfly 600.
Imaris ® for Dragonfly umožňuje uživateli:
- Vykreslovat povrchy a objem ve 3D/4D
- Vytvářet snímky ve vysokém rozlišení
- Vytvářet sofistikované vícerozměrné animace
- Využít pre-processing obrazových dat
Imaris ® for Dragonfly Super-Resolution přidává navíc funkce pro vizualizaci a analýzu 3D SMLM dat:
- Měření objektů: počet, objem, intenzita, plocha a další
- Měření vzdáleností: průměrná vzdálenost mezi nejbližšími objekty, nejkratší vzdálenost k jiným strukturám nebo
k referenčním bodům
- Klasifikace objektů pomocí strojového učení
- Barevné kódování objektů na základě měření
Na vyžádání jsou k dispozici další moduly specifické pro dané aplikace a zahrnují možnosti z balíčků Imaris pro
buněčnou biologii, neurovědy a mnoho dalšího.
OPEN-SOURCE SOFTWARE PICASSO
Firma Andor spolupracovala dlouhou dobu s vývojáři Picasso na
tom, aby bylo možné otevřít a přečíst v tomto open-source programu i soubory získané v softwaru
Fusion. Uživatelé mají k dispozici flexibilitu přejít k softwaru Picasso a načíst v něm 3D
SMLM lokalizační data ve formátu HDF5. 3D vykreslování a statistická měření jsou
pak dokončena v systému Imaris.
Fusion, Imaris a Picasso fungují v harmonii. Picasso přímo čte raw data z Fusion (ve formátu *.ims), lokalizuje
události jednotlivých molekul v osách XY a Z a exportuje lokalizace i voxely. Imaris načítá voxely jako „3D
Volume“ a lokalizace jako „Spots“, vizualizuje, filtruje a provádí analýzu (např. měření nejbližších sousedních
objektů).
